琼脂糖凝胶电泳的原理是什么?
通过荧光染料染色来确定 DNA 的位置， 通过在紫外线下检查凝胶，荧光染料可以检测多达 20 pg 的双链 DNA。琼脂糖凝胶的分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，但分离范围更大。 在这个过程中，50 bp 到几兆碱基的 DNA 可以在琼脂糖凝胶中分离（最适合 50-20,000 bp）。琼脂糖是一种线性聚合物，它包含交替的d - 和l-半乳糖由 α(1-3) 和 β(1-4) 键连接，在 3 和 6 位之间具有脱水桥。它凝胶化以形成尺寸范围从 50 到 ≥ 200 nm的三维通道网格。DNA 样本的迁移率取决于前一章所述的各种因素。因素之一是 DNA 样本的大小。琼脂糖凝胶电泳是的方法凝胶电泳中使用的生物化学，分子生物学，遗传学和临床化学大分子如DNA或蛋白质的混合群体中的基质中分离的琼脂糖，的两个主要部件中的一个的琼脂。蛋白质可以按电荷和/或大小分开（等电聚焦琼脂糖电泳基本上与大小无关），而DNA和RNA片段可以按长度分开。通过施加电场分离生物分子将带电分子移动通过琼脂糖基质，生物分子在琼脂糖凝胶基质中按大小分开。琼脂糖凝胶易于浇铸，带电基团相对较少，特别适合分离实验室中最常遇到的大小范围的DNA，这也是其使用广泛的原因。分离的 DNA 可以用染色剂观察，最常见的是在紫外线下，DNA 片段可以相对容易地从凝胶中提取。大多数使用的琼脂糖凝胶溶解在合适的电泳缓冲液中的 0.7-2% 之间。特性在托盘中浇注的琼脂糖凝胶，用于凝胶电泳琼脂糖凝胶是一种三维基质，由超螺旋束中的螺旋琼脂糖分子聚集成三维结构，具有生物分子可以通过的通道和孔。 3-D 结构通过氢键结合在一起，因此可以通过加热回液态来破坏。熔化温度与凝胶温度不同，根据来源不同，琼脂糖凝胶的凝胶温度为 35-42°C，熔化温度为 85-95°C。还提供通过化学修饰制成的低熔点和低凝胶琼脂糖。琼脂糖凝胶具有大孔径和良好的凝胶强度，使其适合作为 DNA 和大蛋白质分子电泳的抗对流介质。1% 凝胶的孔径估计为 100 nm 至 200-500 nm，其凝胶强度允许将凝胶稀释至 0.15% 以形成凝胶电泳平板。然而，低浓度凝胶 (0.1–0.2%) 易碎，因此难以处理。琼脂糖凝胶对 DNA 的分辨能力低于聚丙烯酰胺凝胶，但具有更大的分离范围，因此用于大小通常为 50-20,000 bp 的 DNA 片段。它还可以用于分离大蛋白质，它是有效半径大于 5-10 nm 的颗粒凝胶电泳的首选基质。0.9% 的琼脂糖凝胶具有足够大的孔，可供噬菌体 T4进入。琼脂糖聚合物含有带电基团，特别是丙酮酸盐和硫酸盐。 这些带负电荷的基团在称为电内渗(EEO)的过程中产生与 DNA 运动相反方向的水流，因此可以延缓 DNA 的运动并导致条带模糊。较高浓度的凝胶将具有较高的电渗流。
琼脂糖凝胶电泳的目的
凝胶电泳在固体支持介质（如琼脂糖凝胶）中按大小分离DNA片段。将样品 (DNA) 移液到样品孔中，然后施加电流，使带负电荷的 DNA 迁移（电泳）向阳极、正极 (+) 端。迁移率与大小成正比：较小的片段移动得更快，并在凝胶底部结束。1.琼脂糖凝胶电泳可以估计用限制性内切酶消化后 DNA 片段的大小，例如在克隆 DNA 的限制性作图中。2.对PCR 产物分析，例如分子遗传学诊断或基因指纹图谱。3.琼脂糖凝胶电泳通常用于解析具有不同超螺旋拓扑结构的环状 DNA，以及解析因 DNA 合成而不同的片段。4.除了为片段大小分析提供出色的介质外，琼脂糖凝胶还可以纯化 DNA 片段。
碱性琼脂糖凝胶电泳颜色
我曾经在实验室里做过碱性琼脂糖凝胶电泳，观察到的颜色是淡紫色。解碱性琼脂糖凝胶电泳颜色一般为淡紫色，但也可能会有其他颜色，比如绿色、灰色等，这取决于凝胶中的蛋白质种类和浓度。拓展：碱性琼脂糖凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析技术，它可以用来分析蛋白质的种类、浓度和结构，是一种非常有用的实验技术。【摘要】
碱性琼脂糖凝胶电泳颜色【提问】
我曾经在实验室里做过碱性琼脂糖凝胶电泳，观察到的颜色是淡紫色。解碱性琼脂糖凝胶电泳颜色一般为淡紫色，但也可能会有其他颜色，比如绿色、灰色等，这取决于凝胶中的蛋白质种类和浓度。拓展：碱性琼脂糖凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析技术，它可以用来分析蛋白质的种类、浓度和结构，是一种非常有用的实验技术。【回答】
能不能再展开讲讲？【提问】
碱性琼脂糖凝胶电泳颜色一般为淡紫色，但也可以根据实验需要，使用不同的染料，调节凝胶的颜色，比如使用荧光染料，可以获得绿色或者橙色的凝胶。此外，碱性琼脂糖凝胶电泳还可以用于检测DNA和蛋白质，可以检测到大分子的结构和组成，以及它们之间的相互作用。【回答】
你想知道的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
【原理】兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
【核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液 中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。也就是说 —— DNA上有磷酸根，在一般情况下带负电，所以必然朝正电方向前进】
一、制配胶
二、上样
1、根据你想要的量来进行跑。例如：10μl 样品，4、6μl Mark，用微量移液枪小心加入样品槽中。
【用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿】
三、电泳
1、加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流在40 mA以上。横压跑
2、当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时（约40 min），停止电泳。
3、打开电脑和观测仪器， 紫外下拍照并观察。
注：PCR产物跑完胶结束后可放到4℃冰箱
备注：
1、凝胶厚度和孔径大小
一般而言， 较厚的凝胶 运行过程中产生热量也较多，可导致条带扩散。 由于凝胶染色的高背景或凝胶染色和/或脱色所需时长(如进行 电泳后染色 )，可能会出现可视化不佳的情况。 对于 琼脂糖 凝胶，厚度以3 - 4 mm为佳，不推荐超过5 mm厚度的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶 的厚度由制造商提供的用于凝胶灌制的垫片决定，最常见的是0.75 mm,1.0 mm,1.5 mm。
由 胶梳形状决定的 孔径大小，不仅影响样品的装载量，而且会影响条带的分辨率。 虽然较大的孔可容纳更大的样品负载，但同时也会产生粗条带，减少条带分辨率并产生污点。 而长而窄的孔可容纳的样品量虽小，但可提供更清晰的条带，以获得更好的分辨率。 减少高密度样品的进样量可提供更高强度的条带。
2、跑电泳的时间
电泳的时间短，不同长度片段的DNA条带还未分离，都聚集在一起，所以只能看见DNA含量最高的主带；而电泳时间比较长，不同长度片段的DNA条带已经分离，可以清晰看到不同长度片段的DNA条带。
3、跑出的DNA带模糊
DNA琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA
核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是：
1、样品的物理性状
即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
2、支持物介质
琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适用于分离不同浓度范围的核酸分子。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的DNA分子。
3、电场强度
电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过4V/cm。而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
4、缓冲液离子强度
核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统。TAE价格低廉，但缓冲能力低。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。
在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。
缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。
核酸电泳中以前常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。BE见光分解，应在避光条件下4℃保存。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA损伤不是很大，所以也比较适用。但EB有毒，现实验室已基本不用，用核酸燃料代替EB。
1、若使用溴化乙锭（EB）需注意安全，EB为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。
2、预先加入EB时可能使DNA的泳动速度下降15%左右，而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB，染色步骤可省略；若凝胶放置一段时间后才观察，即使原来胶内或样品已加EB，也建议增加此步。
3、制胶若形成气泡需在凝胶液未凝固之前及时清除，否则，需重新制胶；上样时也不要有气泡，容易使样品飘散。
琼脂糖凝胶电泳怎么检测DNA质量？什么是标准？
如果DNA出现降解或者是混有其他杂质，例如蛋白质、RNA的话，那么琼脂糖凝胶就能够检测得到DNA的质量。标准主要是通过观察电泳条带的亮度，通过亮度就可以粗略地计算出DNA条带的含量。如果DNA出现损失，对应的条带就会变暗或者是消失。线性的单一DNA样品一般是单条带,质粒的话可能会有2-3条带.如果条带变宽、变暗、或者变成弥散的DNA条带,表示DNA非特异的降解.如果条带变成多条,表示可能被酶切.如果质粒被单酶切,可能变成一条亮带.如果有蛋白质污染,上样孔可能发亮.如果有RNA污染,可能小分子量部分会有弥散.
