在做原核表达时带his组氨酸的目的蛋白怎么也结合不上镍柱，为什么？
首先找一种正常的标签蛋白进行一下纯化试验，如果能够纯化出来那就是你的蛋白的问题，可能是蛋白在表达的时候非正常折叠，标签被折叠在内部，没有在蛋白表面游离着，这样的话当然不会被镍柱捕获了。比较严重的情况就是包涵体的形成，是否形成包涵体你可以根据蛋白的性质反应或者是电泳检测一下离心后的细胞破碎液上清和沉淀中目的蛋白的分布情况。如果形成包涵体那你就需要先使蛋白质尽可能的溶解了，可以加入一些变性剂，比如尿素。当标签暴露出来之后就比较容易挂柱了。
在大肠杆菌中有哪些常用的启动子？调控机制
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)
、lpl
(l噬菌体的左向启动子)、t7噬菌体启动子等。
（1）lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是dna分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(laci)、启动基因(p)、操纵基因(o)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过cap(catabolite
gene
activation
protein)因子和camp来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生lacz阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如iptg可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与o基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。
（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。
（3）tac启动子：tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比lac和trp都强。其中tac
1是由trp启动子的－35区加上一个合成的46
bp
dna片段(包括pribnow
盒)和lac操纵基因构成，tac
12是由trp的启动子-35区和lac启动子的-10区，加上lac操纵子中的操纵基因部分和sd序列融合而成。tac启动子受iptg的诱导。
（4）lpl启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子。lpl启动子受控于温度敏感的阻遏物
cits857。在低温(30℃)时，cits857阻遏蛋白可阻遏pl启动子转录。在高温(45℃)时，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl启动子转录。系统由于受cits857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导pl启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体ci+溶源菌，并用丝裂霉素c或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。
（5）t7噬菌体启动子：它是来自t7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有t7rna聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。t7rna聚合酶的效率比大肠杆菌
rna聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌rna聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有t7rna聚合酶。应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。
蛋白过镍柱纯化的过程中 咪唑是哪部用的啊 什么原理啊 谢谢大家！！
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。这是我的经验，楼主可以多方面参考下别人的。喜欢推荐我的答案哦，~\(≧▽≦)/~
